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Klonierung und Charakterisierung von Serotonin Rezeptoren der Honigbiene Apis mellifera

  Jana Schlenstedt
   
Betreuer Dr. Wolfgang Blenau

 

 
Thema
Das biogene Amin Serotonin ist in Invertebraten, sowie Vertebraten ein Neurotransmitter, - hormon und –modulator. Durch die Interaktion mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren beeinflusst Serotonin eine Reihe von Verhaltensweisen und physiologischen Funktionen. Innerhalb der Vertebraten teilt man die Serotonin Rezeptoren, entsprechend ihrer Pharmakologie und dem intrazellulärem Signalweg, in 7 Unterklassen ein.

In der Honigbiene ist bis zum jetzigen Zeitpunkt kein Serotonin Rezeptor charakterisiert. Ziel der Arbeit ist nach dem Klonieren und Identifizieren der molekularen Struktur der Serotonin Rezeptoren, die Darstellung der Gewebsverteilung mittels Immunohistochemie und in situ Hybridisierung, sowie die Charakterisierung der intrazellulären Signalwege und der Pharmakologie durch heterologe Expression.
 
In situ Hybridisierung des 5-HT7 Rezeptors. Markiert sind die Somata des intrinsischen Pilzkörperchen Zellen, der optischen Loben und des Deuterocerebrum.

Bis zum jetztigen Zeitpunkt konnten wir aus einer cDNA Bibliothek der Honigbiene Apis mellifera 3 Serotonin Rezeptoren, bzw. Teile davon isolieren. Durch Sequenzvergleiche mit verwandten Arten läßt sich schließen, dass es sich bei der isolierten cDNA um einen 5-HT7, 5-HT1 und 5-HT2 Rezeptor handelt.

Mittels RT-PCR und in situ Hybridisierung konnte das Vorkommen der mRNA der 3 Serotonin Rezeptoren in unterschiedlichen Geweben der Honigbiene nachgewiesen werden. Eine Affinitätsreinigung lieferte einen polyklonaler Antikörper gegen den 5-HT7 Rezeptor, dessen Spezifität durch Westernblotanalysen und Präabsorbtionsstudien nachgwiesen werden konnte. Ebenso steht von diesem Rezeptor eine stabile Zelllinie (Human Embryonal Kidney cells) zur Verfügung, an welcher die Pharmakologie geprüft wird.
 

Methoden

 

- In situ Hybridisierung
- RT-PCR
- Heterologe Expression in HEK Zellen -Zellkultur
- Überexpression und Reinigung von Fusionsproteinen
- Affinitätsreinigung von Antikörpern
- Western Blot & Immunohistochemie

 
Literatur Bicker,G. (1999). Biogenic amines in the brain of the honeybee: Cellular distribution, development, and behavioral functions. Microsc.Res.Tech. 44,166-178.

Blenau,W., Baumann,A. (2003). Aminergic signal transduction in invertebrates: Focus on tyramine and octopamine receptors. Recent Res.Devel.Neurochem. 6,225-240.

Pietrantonio,P.V., Jagge C., McDowell C. (2001). Cloning and expression analysis of a 5HT7-like serotonin receptor cDNA from mosquito Aedes aegypti female excretory and respiratory systems. Insect Molecular Biology 10(4),357-369.

Sadou,F., Boschert,U., Amlaiky,N., Plassat,J.L., Hen,R. (1992). A family of Drosphila serotonin receptors with distinct intracellular signalling properties and expression patterns. EMBO J 11 (1),7-17.

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